引  言

　　本文描述的实验方法可以通过终点鲎试剂（Limulus amebocyte lysate, LAL）法实现定量分析纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素的含量。本法是根据Pirece公司的QCL-1000试剂盒以及美国国家药典（United State Pharmacopeia, USP）标准85“细菌内毒素检测”以及美国NCL提供的方法编写的[1-3]。亦可参照国家标准，对样品进行检测[4-6]。 

　　                            鲎试剂法终点显色法定量检测纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素含量

　　             Detection and quantification of gram negtive bacterial endotoxin

                contamination in nanoparticle formulations by end point chromogenic

                                        limulus amebocyte lysate(LAL) assay

1.原理

　　革兰氏阴性菌内毒素可与LAL中的一种酶反应，释放出黄色的p-硝基苯胺（p-nitroaniline, pNA）。加入冰醋酸或十二烷基硫酸钠（SDS）可以终止p-硝基苯胺的释放，底物可通过405nm的吸光度测量。样品中内毒素的浓度直接与吸光度是成比例的，可根据标准曲线计算出来。本检测方法大概需要1mg左右的纳米材料。 

2.仪器与试剂

　　以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的，可以由同类产品的其他供货商所替代。

　　2.1 试剂

　　2.2 耗材　

　　移液管（2mL，5mL，10mL）、96孔平底细胞培养板、一次性无内毒素玻璃管（12x75mm，ACC, TB240）、无热源离心管（15mL） 

　　2.3 仪器

　　离心机、冰箱（4°C和-20°C）、生物安全柜（可处理生物相关材料）、涡旋混匀仪、酶标仪 

3.试剂配制

　　3.1 氢氧化钠溶液（0.1N）：使用无热源的水配制一定体积的0.1N NaOH溶液，使用无热源的离心管储存。

　　3.2 盐酸溶液（0.1N）：使用无热源的水将HCl储存液稀释至0.1N，使用无热源的离心管储存仪器。

　　3.3 参考标准内毒素（RSE）储存液：试剂盒中提供的干粉状大肠杆菌脂多糖（E.coli lipophlusaccharide, LPS）是经过USP认证的参考标准内毒素（Reference standard endotoxin, RSE）。将其溶于1mL无热源水中，终浓度控制在15-40U/mL。实际浓度取决于每个试剂盒提供的分析证书上的数据。每次使用前，储存液需彻底混匀，并达到室温。

　　3.4 计算标液（C1-C4）：下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为4.3中提及的RSE储存液，X为储存液的浓度。

　　3.5 质控标液（Q1）：下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为4.3中提及的RSE储存液，X为储存液的浓度。纳米粒子溶液的浓度应与实验中待测样品浓度相当。

　　3.6  抑制或增强对照（IEC）：下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为3.3中提及的RSE储存液，X为储存液的浓度。纳米粒子溶液的浓度应与实验中待测样品浓度相当。

4.样品制备

　　样品建议溶解于无热源的水中，或是无菌无热源的PBS中，终浓度为1.0mg/mL。使用0.1N NaOH或0.1N HCl调节样品溶液的pH值至6.0-8.0。为避免样品被pH电极污染，通常取出少量体积，使用pH试纸测试。如果样品溶于PBS中，则空白PBS也需在实验中进行检测

5.测量步骤

　　5.1 将上述配制好的溶液按照图1所示加入37°C预热的无菌96孔板中，每孔50mL。其中空白水对照4孔，其余对照及待测样品，每种溶液2孔。37°C培养5min。（加入前，彻底混匀所有的溶液）。

　　5.2 将LAL试剂加入到所有孔中，每孔50mL。轻轻摇动混匀，37°C培养10min。

　　5.3 将显色底物溶液加入到所有孔中，每孔100mL。轻轻摇动混匀，37°C培养6min。

　　5.4 将终止溶液（10% SDS）加入到所有孔中，每孔50mL。轻轻摇动混匀。

　　5.5 使用酶标仪读取405nm处的吸光度。

　　5.6 图1：96孔板加样图例。其中Q1为质控标液，C1-C4为计算标液，IEC为抑制/增强对照。

6.数据分析

　　6.1 变化系数百分比：CV% = SD/mean x 100，其中SD为标准偏差，mean为平均值。

　　6.2 理论误差百分比（Percent Difference from Theoretical, PDFT）：PDFT =（RSE浓度计算值 - RSE浓度理论值）/ RSE浓度理论值 x 100%。

　　6.3 利用线性回归法做出标准曲线。

7.接受标准

　　7.1 对于每个对照组以及检测的样品，CV%和PDFT不能超过25%。

　　7.2 如果质控溶液没能达到上述接受标准，此检测需要重复。

　　7.3 标准曲线的相关系数不小于0.980。

　　7.4 如果标准曲线不能符合8.1和8.3的接受标准，此检测需要重复。

　　7.5 在本实验进行之前，应先检测待测样品本身是否在405nm有吸收。在96孔板中，加入50mL样品溶液，150mL无热源水和50mL终止溶液，不孵育，直接检测405nm处的吸光度。如果吸光度大于水的吸光度，则说明样品本身有吸收，需将本实验中“水”作为空白对照，改为“样品溶液直接混合终止溶液”为空白对照。

　　7.6 IEC的测量值与样品溶液测量值之间的差值应为0.4EU/mL±25%，即0.3~0.5EU/mL。如果差值在此范围以外，则该浓度的样品对内毒素检测是有影响的（抑制或增强）。则需要使用稀释法，对样品进行稀释后，再测量IEC。直到找到一个对内毒素检测无影响的合适的样品浓度。如下表示例。

　　7.7 美国食品药品管理局（Food and drug administration, FDA）批准了以下相关的上限标准：设备：0.5EU/mL，与脑脊液接触的设备为0.06EU/mL；非肠道药物：K/M。K为法定限制，5EU/kg。M为每小时最大的用药剂量；鞘内注射的非肠道药：K/M。K为法定限制，0.2EU/kg。M为每小时最大的用药剂量。如没有提供K/M值，纳米粒子相关配方将以设备标准为准。

8.缩略语

　　EU：内毒素单位（标准鲎试剂的最低促凝胶活性值定为内毒素单位1EU）

　　FBS：胎牛血清

　　LAL：鲎试剂

　　LPS：脂多糖

　　IEC：抑制/增强对照

　　min：分钟

　　PBS：磷酸缓冲盐溶液

　　PDFT：理论误差百分比

　　RSE：参考标准内毒素

　　SDS：十二烷基硫酸钠

　　USP：美国国家药典

　　v/v：体积比

9.参考文献

[1]Pierce® LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation kit instruction (#88282), Thermo Fisher Scientific Inc.

[2]USP34-NF29. <85>. Bacteria Endotoxins. Rockville, MD: United States Pharmacopeia. (2011) 1: 78-81.

[3]Dobrovolskaia MA, Neun BW. NCL Method (2011) STE-1.1 (Version 1.2):1-10.

[4]ISO-29701纳米技术纳米材料体外内毒素试验鲎试剂（LAL）测定法（Nanotechnologies-Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems-Limulus amebocyte lysate(LAL) test）.

[5]GB/T14233.2-2005，医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法。

[6]YY/T 1295-2015，医疗器械生物学评价 纳米材料：细菌内毒素试验。

                                                        国家纳米科学分析报告