引 言
本文描述了一种监测经纳米粒子处理的猪近端肾小管细胞（porcine renal proximal tubule cells, LLC-PK1）凋亡的实验方法。本方法利用荧光方法确定半胱天冬酶3（caspase-3）的活化程度。
肾细胞凋亡检测
Apoptsis assay for kidney cells
1.原理
Caspase-3荧光蛋白酶检测基于以下原理。哺乳动物细胞的凋亡始于半胱氨酸蛋白酶中caspase家族的活化。本实验通过检测caspase-3的底物乙酰基-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）-7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin, AMC）酶解后游离AMC所产生的荧光（λex=380nm, λem=460nm），对caspase-3的活化进行体外定量分析。游离AMC可以通过酶标仪定量检测[1-3]。
2.仪器与试剂
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2.1 试剂
2.2 耗材
96孔板平底细胞培养板、离心管（15mL）、6孔平底细胞培养板、96孔荧光检测板（全黑）
2.3 仪器
离心机（带有96孔板适配器）、冰箱（4℃和-20℃）、细胞培养箱（37℃，5% CO2，95%湿度）、生物安全柜（可处理生物相关材料）、倒置光学显微镜、血细胞计数器（细胞计数仪）、涡旋混匀仪、酶标仪、平板振荡器
2.4 细胞系
3.试剂配制
3.1 M199完全培养基（无菌）：5%FBS（经过热灭活）、2mM Glutamax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1.5g/L to 2.2g/L NaHCO3。避光保存在2-8℃，不超过一个月。使用前，要37℃水浴中预热。
3.2 5μM顺铂，阳性对照（positive control，PC）：在DMSO中配制50mM顺铂储存液。将50mM储存液用M199完全培养基稀释至5μM。0.2μm过滤除菌。
3.3 阴性对照（negative control，NC）：M199完全培养基。
3.4 提前配制的溶液（参见Caspase-3荧光检测试剂盒，-20℃保存）：
3.4.1 根据实验用量，将1x检测缓冲液（assay buffer）用水（试剂盒提供）稀释至1x检测缓冲液。
3.4.2 将2.5mg caspase-3底物（Ac-DEVD-AMC）溶于370μL DMSO，终浓度为10mM，分装后-20℃保存。
3.4.3 将0.5mg caspase-3抑制剂（Ac-DEVD-AMC）溶于500μL DMSO，终浓度为2mM，分装后-20℃保存。工作液为1x检测缓冲液稀释至200μM。
3.4.4 将5μg caspase-3阳性对照溶于50μL水中（试剂盒提供），终浓度为1000μg/mL，分装后-70℃保存.使用前，用1x检测缓冲液稀释至200μM。
3.4.5 反应液配制：每孔加200μL反应液，根据需要配制相应体积。如将5μL 10mM的底物Ac-DEVD-AMC加入到3mL 1x检测缓冲液中，避光保存。
3.4.6 AMC标液配制：1mg AMC标物溶于0.57mL DMSO中，终浓度约为10mM。精确浓度需用紫外吸收法测量。用1x检测缓冲液将AMC溶液稀释200倍，放入石英比色杯中，测量354nm处的吸光度（A354）。根据朗勃特-比尔定律公示A354=εbc，其中ε为354nm处的摩尔消光系数16，b为比色杯的厚度（cm），c为蛋白浓度（mol/L，M）。
3.4.7 将5x裂解液用水（试剂盒提供）稀释为1x裂解液，4℃保存。
3.5 热灭活FBS：在2-8℃解冻一瓶FBS，热灭活前恢复至室温。放入56℃水浴中30min，并且每隔5min混匀一次。根据每次实验的用量（~50mL），分装后保存在-20℃。每次使用前，在2-8℃解冻。剩余FBS可在2-8℃保存一个月。
4.样品制备：纳米粒子样品溶液的配制
根据LLC-PK1肾细胞毒性实验（NCNST-IVT-131）确定待测样品的浓度。将纳米粒子完全溶解在M199完全细胞培养基中，浓度为检测浓度的2倍（2x）。如果被检测的纳米粒子的最高工作浓度为1mg/mL，那么需要检测的浓度按照1:5的稀释比例，依次稀释至0.2mg/mL、0.04mg/mL和0.008mg/mL。每一个浓度的纳米粒子应该准备至少4个平行测定（n=4）。
5.实验步骤[4,5]
5.1 培养细胞2天后，细胞密度达到80-90%。收集细胞，用台盼蓝进行细胞计数。如果活细胞比例达到90%以上，可以继续后面的实验。
5.2 将细胞重悬至M199完全培养基中，终浓度为2.5×105cell/mL。
5.3 在96孔细胞培养板中，每孔加入200μL上述细胞悬液（5×104个细胞/孔）。PC和NC需准备3个平行测定，待测样品4个平行测定（见图1）。
5.4 在37℃，5% CO2，95%湿度的培养箱中孵育培养板24h（细胞密度应达到80%）。
5.5 按照图1所示，将细胞培养基分别换成200μL M199完全培养基（NC）、含纳米粒子溶液（步骤4中配制）和PC溶液。设置时间点为6h、24h和48h。
图1 细胞培养加样示例
5.6 Caspase-3活性检测
5.6.1 将孔中培养基吸出，用100μL室温1xPBS洗细胞，将96孔板置于冰上。
5.6.2 每孔加30μL冷的1x裂解液，在冰上放置15-20min。将细胞裂解液收集在EP管中。
5.6.3 离心，2000xg（或10000rpm），4℃，10min。
5.6.4 转移10μL上清至96孔荧光检测板中，并在每个样品孔中加入200μL反应液。其余上清（~20μL）用于蛋白测定。并安排两个空白反应液平行孔（200μL反应液）和两个caspase-3对照平行孔（10μL caspase-3+200μL反应液）。（图2）
5.6.5 37℃孵育1-1.5h。
5.6.6 在酶标仪上读取激发波长为380nm、发射波长为460nm的荧光强度（狭缝宽度为5nm）。
图2 荧光检测加样示例
5.7 蛋白测定（Bradford检测）
5.7.1 使用前，现将1x Quick Start Bradford蛋白染色液恢复至室温，反复倒转使里面液体充分混匀。
5.7.2 用0.05M NaOH稀释2mg/mL的BSA储存液，按照表1配制一系列BSA标液，绘制浓度范围为125-1500μg/mL标准曲线。每个标液准备3个平行测定。
表1 BSA系列标液的配制方法
5.7.3 根据图3，在96孔细胞培养板中加入5μL标液（5.7.2中制备的）、细胞裂解物（5.6.4中制备的）或空白（水）。准备三个平行测绘制浓度范围为125-1500μg/mL标准曲线。每个标液准备3个平行测定。
5.7.4 每孔加入250μL 1x蛋白染色液。
图3 蛋白测定加样示例
5.7.5 室温孵育至少5min，不长于1h。
5.7.6 用酶标仪检测595nm处的吸光度OD。
6.数据分析
6.1 对BSA标准曲线进行线性回归分析（y=x（斜率）+y（截距）），并根据样品吸光度计算样品的蛋白浓度。根据下面的方程计算蛋白浓度（根据5.6.4，样品体积约为20μL）：
6.2 变化系数百分比：CV%=SD/平均值×100，其中SD为标准偏差。
6.3 总蛋白标归一化后的Caspase活性：
样品荧光和NC的荧光均为扣除空白背景值后的荧光强度。
每个阳性对照和样品均需计算均值、SD和CV%。
7.接受标准
7.1 24h PC的caspase活性至少为NC的10倍。
7.2 PC、NC和样品平行测定的CV%应在50%以内。
7.3 达到7.1和7.2标准的检测结果可以被接受。否则，应重复实验直到达到接受标准。
7.4 对实验数据进行统计分析，如果总蛋白归一化的NC和样品荧光值之间具有显著性差异，则认为荧光变化是显著的，说明样品的处理显著地影响了细胞凋亡。
8.缩略语
AMC：7-氨基-4-甲基香豆素
BSA：牛血清白蛋白
CV：变化系数
DEVD：天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸
DMSO：二甲亚砜
DTT：二硫苏糖醇
FBS：胎牛血清
h：小时
LLC-PK1：猪肾细胞
λex：激发波长
λem：发射波长
min：分钟
NaOH：氢氧化钠
PBS：磷酸盐缓冲液
SD：标准偏差
9.参考文献
[1] ISO 10993-5 Biological evaluation of medical devices: Part 5 Tests for in vitro cytotoxicity.
[2] F1903-98 Standard Practice for Testing for Biological Responses to Particle in vitro.
[3] Wang et al. Cell Bio. Int.(2005) 29: 489-496.
[4] The datasheet of Caspase-3 Fluorometeric Assay kit from Sigma(#CASP3F).
[5] Stem ST, Potter TM. LLC-PK1 kidney cell apoptosis assay. NCL Method(2010) GTA-5(Version 1.1)：1-11.
国家纳米科学中心分析报告
