引  言

　　本文描述的方法是利用氧化还原活性的荧光探针，检测纳米粒子对于肝癌细胞（Hep G2）活性氧（reactive oxygen species, ROS）形成的影响。

　　                                                  肝癌细胞活性氧检测

　                                       　ROS assay for hepatoma cells

1.原理[1,2]

　　二氯荧光黄双乙酸盐（Dichlorofluoresceindiacetate, DCFH-DA）是一种ROS探针，它在细胞内会经历脱乙酰作用，之后由ROS介导的氧化生成荧光物（激发波长λ_ex=485nm，发射波长λ_em=530nm）。DCFH-DA可被用来测量细胞质和细胞器（如线粒体）中ROS的生成。可用微板分光光度计定量检测荧光强度。

2.仪器与试剂

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　　2.2 耗材

　　移液管（2mL，5mL，10mL）、96孔平底细胞培养板、离心管（15mL）、黑色Costar 96孔板。

　　2.3 仪器

　　离心机、冰箱（4℃和-20℃）、细胞培养箱（37℃，5% CO₂，95%湿度）、生物安全柜（可处理生物相关材料）、倒置光学显微镜、血细胞计数器（细胞计数仪）、涡旋混匀仪、酶标仪。

　　2.4 细胞系

　　Hep G2（人肝癌细胞系）

3.试剂配制

　　3.1 DMEM完全培养基（无菌）：10% FBS（经过热灭活）、2mM Glutamax、100U/mL 青霉素、100μg/mL链霉素。避光保存在2-8℃，不超过一个月。使用前，要37℃水浴中预热。

　　3.2 DEM，阳性对照（positive control, PC）：用DMEM完全培养基（3.1中所述）制备5mM DEM 溶液。

　　3.3 阴性对照（negative control, NC）：DMEM完全培养基。

　　3.4 ROS荧光探针试剂：（在暗室中制备，溶液需避光！）（1）DCFH-DA储液（10mM）：5mg溶解于1mL DMSO。（2）DCFH-DA工作液（40μM）：50mL 1xPBS中加入200μL 10mM储液。

　　3.5 DCF: （在暗室中制备，溶液需避光！）（1）DCF储液（225mM）100mg溶解于1mL DMSO。（2）DCF工作液（40μM）：50mL 1xPBS中加入8.9μL 225mM储液。

　　3.6 热灭活FBS：在2-8℃解冻一瓶FBS，热灭活前恢复至室温。放入56℃水浴中30min，并且每隔5min混匀一次。根据每次实验的用量（~50mL），分装后保存在-20℃。每次使用前，在2-8℃解冻。剩余FBS可在2-8℃保存一个月。

4.样品制备：纳米粒子样品溶液的配制

　　4.1 如果被检测的纳米粒子的最高工作浓度为1mg/mL，那么需要按照1:5的稀释比例，使用维持培养基依次稀释至0.2mg/mL、0.04mg/mL和0.008g/mL。每一个浓度的纳米粒子应该设置4个平行测定。

　　4.2 选择合适的纳米粒子溶液的浓度时，必须考虑以下几个问题：（1）纳米粒子在某种生物相容性缓冲液中的溶解度（2）用NaOH或HCl调节纳米粒子至生理pH值（6-8）。（3）纳米粒子的可用性及稳定性。 

　　如果1mg/mL的最高工作浓度不适合，需要对此浓度进行调整，一定要在适合的浓度下分析样品。

5.实验步骤

　　5.1 预实验Ⅰ（检测样品是否干扰ROS检测）

　　5.1.1 细胞培养两天后，使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞。用DMEM 完全培养基将细胞稀释到4x10⁵cell/mL。

　　5.1.2 在黑色96孔板中，按照表1，每孔加入100μL细胞悬液，在37℃、5%CO2和95%湿度的培养箱中孵育24h。

　　5.1.3 按照表1，在每个样品中加入100μL 40μM DCFH-DA（终浓度为20μM），对照组为1x DPBS，在37℃、5%CO₂和95%湿度的培养箱中孵育30min。

　　5.1.4 70xg离心培养板4min。去除上清，用200μL 1xPBS洗细胞。70xg离心培养板4min（不包括降速时间）。

　　5.1.5 去除上清后，按照表1，每孔加入200mL 5mM DEM 孵育细胞1h。

　　5.1.6 去除上清后，在相应的孔加入200μL不同浓度的纳米粒子溶液，读取相应的荧光值（λ_ex=485nm，发射波长λ_em=530nm）。

　　                                                    表1 预实验Ⅰ每个实验组的加样设计方案

　　5.1.7 比较B-A与D-C两个差值，根据T-test结果，判断样品本身是否会影响ROS检测，在后续正式实验中，避免使用有影响的样品浓度。

　　5.2 预实验Ⅱ（检测DCF与AgNPs是否干扰ROS检测）

　　5.2.1 在96荧光板中每孔加入100μL 40μM DCF，对照组为1xDPBS。

　　5.2.2 按照表2，在相应的孔中加入100μL不同浓度的纳米粒子溶液，（避光！）分别孵育0、3和12h后将对应的培养板从培养箱中取出，读取相应的荧光值（激发波长λ_ex=485nm，发射波长λ_em=530nm）。

　　                                                   表2 预实验Ⅱ每个实验组的加样设计方案

　　5.2.3 B-A与D-C两个差值，根据T-test结果，判断DCF与AgNPs是否干扰ROS检测。

　　5.3 ROS实验检测

　　5.3.1 细胞培养两天后，使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞。用DMEM完全培养基将细胞稀释到4×105个/mL。

　　5.3.2 按照图1，除空白孔外（培养基对照），每孔加100μL细胞。无细胞对照组均设2个平行测定，阳性对照、阴性对照和待测样品均设4个平行测定。根据纳米粒子不同的作用时间，共设置3个96孔板，分别对应2、4和6h。

　　                                 图1 加样图例。其中“细胞+培养基”为NC，“培养基+DEM”为PC

　　5.3.3 在37℃、5%CO2和95%湿度的培养箱中孵育24h。

　　5.3.4 （避光操作！）在每个样品中加入100μL 40μM DCFH-DA（终浓度为20μM），在37℃、5%CO₂和95%湿度的培养箱中孵育30min。

　　5.3.5 70xg离心培养板4min。去除上清，用200μL 1xPBS洗细胞。70xg离心培养板4min（不包括降速时间）。

　　5.3.6 去除上清后，之后按图1在每板中加入200μL不同浓度的纳米粒子溶液。

　　5.3.7 避光！）分别孵育0、3和12h后将对应的培养板从培养箱中取出，读取相应的荧光值（λ_ex=485nm，λ_em=530nm）。

6.数据分析

　　6.1 变化系数百分比：CV% = SD/mean x 100，其中SD为标准偏差，mean为平均值。

　　6.2 阴性对照、阳性对照和待测样品的荧光值，应该是各自孔的测量值减去相应的无细胞对照组测量值的平均值。

7.接受标准

　　7.1 阳性对照DEM 2h的荧光测量值应至少为培养基对照的140%。

　　7.2 阳性对照和样品的平行测定的CV%应小于50%。

　　7.3 达到7.1和7.2标准的检测结果可以被接受。否则，应重复实验直到达到接受标准。

8.缩略语

　　CV：变化系数

　　DCFH-DA：二氯荧光黄双乙酸盐

　　DEM：马来酸二乙酯

　　DMSO：二甲亚砜

　　FBS：胎牛血清

　　PBS：磷酸盐缓冲液

　　ROS：活性氧

9.参考文献

[1] Black MJ.Brandt RB.Spectroflurometric analysis of hydrogen peroxide. Anal Biochem(1974）58:246.

[2] Stem ST, Zolnik BS. Hepatocyte primary ROS assay. NCL Method(2010)GTA-3(Version 1.0):1-9.

　　                                                   国家纳米科学中心分析报告